常见问题

1、分离方法适用于哪些种类样品中的外泌体提取？

可用于细胞上清液、血清、血浆、尿液及其他低密度体液（如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌体提取。

2、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存？

可以。血样、尿样、体液等，需要攒齐了一起提取，或者同一个患者的样本多次提取。冻存前，首先要离心去除细胞和血小板，再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。长期请保存于-80℃，无须加冻存液；短期（1-2天内）则保存于4℃即可。

3、外泌体提取后是否可以冻存？

可以。使用硅化E.P.管或冻存管，减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融，建议分装，避免多次反复冻融。对于一些功能性实验，建议不要冻存，直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。

4、需要从血浆中分离外泌体，可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗？

不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂，用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。采血管的选择：血浆（plasma）：紫盖采血管；血清（serum）：黄盖采血管（促凝管或促凝管带分离胶）。

5、粘度过大的样品如何处理？

如果样品粘度过大时（因细胞分泌物较多所致），可将样品用1×PBS缓冲液进行等体积稀释。

6、培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？

多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下两种方法：

（1）将细胞培养用的血清通过1×10⁵g超速离心10h以去除血清外泌体；

（2）选择无血清培养基进行细胞培养。

7、无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？

细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

8、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取？

会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占比不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体。

9、如何鉴定提取的外泌体？

通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行Western blot检测时，通常检测外泌体标志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101等）。

10、准备做细胞外泌体Small RNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？

普通肿瘤细胞系推荐使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先通过10kD超滤柱浓缩，准备40mL以上的浓缩液再进行超速离心分离外泌体。

11、进行外泌体RNA RT-PCR实验推荐什么内参？

取决于具体样品，可以选择外源添加cel-miR-39-3p，或内源U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72作为内参。

12、提取的外泌体进行Western blot前是否需要加入RIPA试剂裂解？

需要，一般按照1:1的比例加入RIPA试剂。

13、进行外泌体Western blot鉴定时有无内参蛋白可供选择？

无，该检测属于定性检测。

14、组织细胞外泌体如何提取？

无菌环境下将组织剪成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养12h；将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中；先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再进行超速离心分离外泌体。

厦门恩赛尔生物科技有限公司位于国家级企业孵化基地海沧生物医药产业园，参照GMP标准建设有完善的研发生产实验室并通过厦门市食品药品质量检查研究院依据国家标准GB50457-2008的洁净级别检测，团队汇聚大帮技术精湛的博士、硕士人员及外籍科学家，并由多名“千人计划”专家作为技术顾问，同时兼具遗传咨询师、系统架构师、注册审核员等各类人才，具备专业的科学研究和服务咨询能力。企业定位为工业客户提供标准化的外泌体分离提纯及检测服务，并且在该项技术领域拥有创新突破和权威认可，作为首席科学家兼企业法人代表，叶国栋博士在肿瘤及血液检测技术领域有十数年的技术积累，参与并执笔国内首个《外泌体研究、转化和临床应用专家共识》，未来将继续促进该项标准化技术的落地，为外泌体行业的蓬勃发展贡献一份力量。